El procedimiento consiste en extraer el ADN del organismo donante, cortarlo en fragmentos que contengan entre uno y varios genes e insertar esos fragmentos en un vector capaz de replicarse (por ejemplo un plásmido bacteriano o un fago) y de amplificar el fragmento incorporado en ella, dando lugar a un clon molecular del ADN insertado.
Las moléculas de vector y sus insertos se llaman ADN recombinante porque constituyen combinaciones nuevas de ADN.
Los vectores son esencialmente moléculas de ADN transportadoras.
Pasos que se realizan en la tecnología del ADN recombinante
Aislamiento del ADN
El primer paso es el aislamiento de los ADN donante y vector.
Digestión de ADN
Las técnicas de clonación de genes han llegado de la mano de las endonucleasas de restricción. Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli.
Las endonucleasas de restricción (enzima) del tipo II cortan el ADN en regiones palindrómicas, que son las que tienen simetría binaria (que se lee igual de izquierda a derecha y viceversa.
Tras el corte, se generan fragmentos concretos con extremos cohesivos (pegajosos) apropiados para su inserción en un vector que haya sido cortado con la misma endonucleasa de restricción.
Ligación de ADN
Lo más común es que el ADN donante y el ADN vector se digieran con una enzima de restricción que genere extremos cohesivos y que se unan y formen moléculas recombinantes.
No obstante si esto no ocurre es posible sellar los extremos mediante la adición de la enzima ADN ligasa que crea enlaces fosfodiésteres en los puntos de unión. Algunas ligasas pueden ligar fragmentos de ADN con extremos romos. La enzima desoxinuclotidil transferasa se utiliza para crear colas complementarias mediante la adición de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.
Amplificación del ADN recombinante
El ADN recombinante una vez ligado se introduce en una célula bacteriana mediante transformación. Dentro de la célula receptora el vector plasmídico se replica, ya que los plásmidos suelen tener un origen de replicación.
Construcción de una genoteca de ADN
El principal objetivo de la de la tecnología del ADN recombinante es la clonación de un gen particular o un fragmento genómico de interés para el investigador.
Se empieza con una muestra de ADN y el siguiente paso consiste en obtener una vasta colección de clones a partir de una muestra original. Esta colección de clones se llama genoteca.
Una
genoteca es una colección de clones de ADN que representa todo el genoma de un organismo.
Tipos de genotecas:
Ø Según el vector que se utilice.
Ø Según el origen del ADN
Es posible separar los diferentes fragmentos producidos tras la digestión con una enzima de restricción porque migran en función de su tamaño cuando se someten a electroforesis en gel.
Se pueden detectar clones individuales de una genoteca utilizando
sondas que reconozcan específicamente un ADN o su producto proteico o mediante transformación de un mutante nulo.
Existen dos tipos de sondas: las que reconocen ADN y las que reconocen proteínas.
Los sitios diana para las enzimas de restricción pueden situarse en un mapa y constituyen marcadores que son muy útiles para la manipulación del ADN.
Mapas de restricción: Un mapa de restricción es la recopilación del número, del orden y de la distancia entre los sitios de corte de enzimas de restricción en un segmento clonado de DNA.
La utilización de sondas permite detectar moléculas específicas de ADN o ARN mediante las técnicas de Southern y Northern.
Transferencia de Southern: Método utilizado para transferir fragmentos de ADN desde un gel de agarosa a un gel de nitrocelulosa con el propósito de hibridar ADN con ADN o ADN con ARN en el trabajo con ADN recombinante.
Edward Southern desarrolló la utilización de segmentos de DNA clonado, separados por electroforesis, transferidos a filtros, y rastreados con
sondas.
Además de para caracterizar DNA clonado, la transferencia de southern se utiliza para muchos otros fines:
Ø Proporciona una huella dactilar genética de gran valor en medicina forense.
Ø mapeo de sitios de restricción en un gen o cerca de él
Ø identificación de fragmentos de DNA que contienen un gen determinado de entre una mezcla de muchos fragmentos, y la identificación de genes relacionados en diferentes especies.
Huella genética: (también llamada pruebas de ADN o análisis de ADN) es una técnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su
ADN.
La huella genética se utiliza en la
medicina forense para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen.
También ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados. Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificación de los restos humanos,
pruebas de paternidad, la compatibilidad en la
donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del origen o la composición de alimentos.
Transferencia de northern: técnica de transferencia utilizada para el ARN.
Aplicaciones de la tecnología del DNA recombinante.
La ingeniería genética y la biotecnología están contribuyendo y contribuirán aún mucho más en el futuro a la medicina, la industria y la
agricultura, además de al campo de la investigación básica.
Aplicaciones en investigación y medicina. Es evidente que la producción de proteínas de utilidad médica como la somatostatina, la insulina, la hormona del crecimiento humana y los interferones, es de gran importancia práctica
Un avance especialmente interesante es el uso de maíz y soja transgénicos para producir anticuerpos monoclonales para uso médico. También puede ser posible utilizar plantas desarrolladas mediante ingeniería genética para producir vacunas orales.
Modelos animales de enfermedades genéticas humanas: ratones knockout.
Los ratones knockout están alterados genéticamente de manera que un gen concreto (un gen diana) se ha inactivado y se ha convertido en no funcional.
Terapia génica.
Los métodos de aislamiento y clonación de genes específicos desarrollados originalmente como una herramienta de investigación se están utilizando actualmente para tratar enfermedades genéticas mediante transferencia de alelos normales humanos en un proceso denominado terapia génica.
APLICACIONES EN ANIMALES Y PLANTAS.
Las técnicas de ingeniería genética se aplican a la agricultura y a la ganadería para obtener mayores cosechas y mejores alimentos con plantas y mayor cantidad y calidad en la cría de ganado, etc.
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Organismos transgénicos.
Se denomina organismos transgénicos a los animales y plantas que llevan en su genoma genes “extraños”, es decir, genes introducidos artificialmente y que no proceden de sus antepasados por herencia.
♦ Plantas transgénicas. Las aplicaciones agrícolas tienen como objetivo:
♦ Animales transgénicos.
Plantas transgénicas
Son aquellos que presentan en su ADN genes procedentes de otra especie.
En las plantas la transferencia genética ya se realizó en numerosas especies, lo que dio lugar a variedades que, gracias a los nuevos genes, presentan mejores caracteres que las plantas silvestres, como por ejemplo:
- producción de frutos más grandes, más sabrosos o más ricos en nutrientes; así se consiguió arroz con más vitamina A, maíz más rico en proteínas, tomates de mejor textura y firmeza, etc.
- mayor tolerancia a las condiciones adversas, como a las bajas temperaturas, a la sequía, a la salinidad, etc
- resistencia a ciertas plagas producidas por insectos, virus, etc. Muchas frutas y verduras son resistentes a las plagas de insectos gracias a la transferencia de genes bacterianos que dan lugar a la formación de moléculas que son tóxicas para los insectos, pero no para la planta ni para el hombre. Este logro permitió reducir la necesidad de fumigar los campos de cultivo con pesticidas.
- resistencia a los herbicidas, gracias a los genes transferidos, la planta a cultivar no es afectada por el herbicida, por lo que puede crecer mientras que se destruyen las malas hierbas. Se obtuvieron variedades de maíz, soja y algodón que son transgénicas y resistentes a los herbicidas.
- retraso en la maduración. Es el caso de muchas variedades de tomate.
Para introducir nuevos genes en una planta pueden emplearse diferentes procedimientos. Uno de ellos es el siguiente:
1º. De una bacteria se extrae un plásmido
2º. Mediante la técnica de recombinación de ADN, en el plásmido se inserta el gen que va ser transferido a la planta
3º. El plásmido recombinante obtenido se introduce, mediante diversos métodos, en células vegetales, provocando su incorporación en un cromosoma de la célula.
4º. A partir de cada célula transformada, se desarrollará una planta transgénica que presentará un nuevo carácter, consecuencia del gen que le fue transferido.
Animales transgénicos
Clonar un organismo significa hacer una copia exacta de él mismo.
El clon más famoso es la oveja Dolly nacida en Escocia en 1997. Dolly fue clonada por Ian Wilmut, Keith Campbell y sus colegas en el Instituto Roslin.
Krogh (2000) describe el procedimiento para obtener a Dolly de la siguiente manera:
1- De la oveja adulta que se quiere clonar (oveja A), se extrajeron células de una glándula mamaria.
2-. De otra oveja (oveja B), se aisló un óvulo no fecundado y a éste se le sacó el núcleo utilizando una micropipeta.
3-. Se fusionó una célula mamaria de la oveja A con el óvulo de la oveja B mediante una corriente eléctrica. En el óvulo se encuentran los factores que determinan la división repetida de esta célula hasta formar un embrión.
4-. El embrión se implantó en el útero de una tercera oveja (oveja C), donde completó su desarrollo, naciendo la oveja Dolly, genéticamente igual a la oveja A.
Cada célula de Dolly contiene el mismo ADN nuclear que el que tenía la célula de la glándula mamaria de la oveja donante. En la concepción de Dolly no hubo la fusión de un espermatozoide y un óvulo, como es común en la reproducción sexual, no hubo una mezcla de ADN nuclear.
